Хроматография аминокислот на бумаге

Метод хроматографического разделения смеси аминокислот на бумаге основан на различной растворимости аминокислот в воде и органических растворителях (см. рисунок) .

Хроматография аминокислот на бумаге

Каплю раствора, содержащего смесь аминокислот, наносят на полоску фильтровальной бумаги, которая способна удерживать большое количество воды (неподвижная фаза). Конец полоски опускают в специально подобранный органический растворитель (подвижная фаза). Растворитель поднимается по полоске бумаги и увлекает за собой нанесённые на бумагу аминокислоты. Скорость перемещения аминокислот определяется их растворимостью. Чем больше растворимость аминокислоты в воде и чем меньше её растворимость в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота вслед за подвижной фазой, и наоборот.

По окончании хроматографии расположение отдельных α-аминокислот на фильтровальной бумаге можно выявить при помощи нингидриновой реакции.

Нингидриновая реакция используется для обнаружения и количественного определения веществ, содержащих α-аминогруппы. При нагревании в присутствии нингидрина происходит окислительное дезаминирование α-аминогрупп аминокислот и пептидов, а молекула нингидрина при этом восстанавливается. Восстановленный нингидрин реагирует с аммиаком и другой молекулой окисленного нингидрина, в результате чего образуется окрашенный комплекс синего или сине-фиолетового цвета:

Ход опыта. К 5 каплям раствора α-аланина добавляют 2 капли 0,5%-ного водного раствора нингидрина и кипятят 1—2 минуты. В пробирке появляется розово-фиолетовое окрашивание, а с течением времени раствор синеет.

Для каждой аминокислоты характерна скорость перемещения, которую выражают с помощью коэффициента R_f. Коэффициентом R_f называют отношение пути, пройденного аминокислотой (от места ее нанесения на бумагу до середины пятна на хроматограмме), к расстоянию от места нанесения смеси аминокислот до фронта растворителя:

,

где а – расстояние от места нанесения раствора смеси аминокислот до середины пятна данной аминокислоты, мм; b – путь, пройденный растворителем, мм. Каждая аминокислота имеет определенное значение коэффициента R_f, которое может меняться в зависимости от вида применяемой бумаги, растворителя, температуры, рН среды и некоторых других факторов (таблица).

Табл. 2. Значения R_f отдельных аминокислот (бумага ватман № 1).

Аминокислоты	Растворители
	фенол, насыщенный водой	н-бутиловый спирт – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:1)
Фенилаланин	0,87	0,66
Лизин	0,82	0,16
Аргинин	0,90	0,18
Гистидин	0,69	0,17
Серин	0,36	0,32
Треонин	0,47	0,36
Глицин	0,41	0,34
Аспарагиновая кислота	0,15	0,33
Глутаминовая кислота	0,25	0,37
Тирозин	0,63	0,53
α-аланин	0,56	0,39
Метионин	0,83	0,58
Триптофан	0,75	0,62
Пролин	0.89	0,50
Лейцин	0,87	0,72
Валин	0,76	0,56
Цистин	0,03	0,13