Разные белки отличаются друг от друга по своим физико-химическим свойствам и биологической активности. На этих различиях основаны широко используемые в медицине и биотехнологии методы разделения белковых смесей на фракции и выделения отдельных белков. Механизм некоторых из этих методов представлен на рисунке (щёлкните кнопкой мыши по рисунку для его увеличения).
Для разделения белков по молекулярной массе наиболее часто применяют методы гель-фильтрации, ультрацентрифугирования, диализа и диск-электрофореза.
Гель-фильтрация - метод, основанный на различной способности молекул разных размеров проходить через своеобразные «молекулярные сита» - сефадексы - инертные гидратированные полисахаридные материалы, представляющие собой пористые гранулы. Крупные белковые молекулы не способны диффундировать внутрь гранул сефадекса и элюируются (выходят из колонки) в первую очередь. В то же время молекулы небольшого размера проникают через поры гранул, задерживаются в них и движутся в колонке с более низкой скоростью (см. рисунок, вверху слева). Метод гель-фильтрации эффективно используется и при очистке белков от низкомолекулярных примесей.
Ультрацентрифугирование. Метод основывается на измерении скорости седиментации (осаждения) белковых частиц под действием центробежной силы, создаваемой в ультрацентрифуге. Скорость седиментации частиц пропорциональна их молекулярной массе.
Диализ - процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ при помощи полупроницаемой мембраны. Белки не способны проходить через такую мембрану, поэтому данный метод применяется для очистки белков от неорганических соединений.
Диск-электрофорез в полиакриламидном геле проводят в присутствии детергента - додецилсульфата натрия (ДСН), маскирующего заряд ионогенных групп в молекуле белка. Поэтому электрофоретическая подвижность белков, связанных с ДСН, будет пропорциональна их молекулярной массе.
На различии белков по электрическому заряду основаны методы высаливания, ионообменной хроматографии, электрофореза, изоэлектрического фокусирования.
Высаливание - процесс осаждения белков из раствора при добавлении сульфата аммония, а также солей щелочных и щелочноземельных металлов, чем больше величина заряда белка, тем более высокая концентрация соли требуется для его осаждения.
Ионообменная хроматография - метод, основанный на взаимодействии заряженных групп белка с ионными группами полимеров-ионообменников. При разделении смеси белков на анионите (например, диэтиламиноэтилцеллюлозе) в первую очередь элюируются положительно заряженные белки, затем - нейтральные и, наконец, отрицательно заряженные белки (см. рисунок, вверху справа). При разделении смеси белков на катионообменнике (например, карбоксиметилцеллюлозе) элюция происходит в обратном порядке.
Электрофорез - метод, основанный на различной скорости движения белков в электрическом поле на различных носителях (бумага, полиакриламидный и крахмальный гели и т.д.) . Эта скорость зависит от величины заряда белка при данном значении рН.
Изоэлектрическое фокусирование - методика проведения электрофореза на колонке или в тонком слое с градиентом рН, создаваемом при помощи синтетических полиаминокарбоновых кислот - амфолинов. Каждый белок разделяемой смеси будет располагаться на колонке в участке со значением рН, соответствующем его изозлектрической точке.
Различная гидрофобность белковых молекул используется при проведении гидрофобной (обращённо-фазовой) хроматографии. В качестве носителя в данном случае применяется силикагель с ковалентно присоединёнными углеводородными радикалами. Чем выше гидрофобность белковой молекулы, тем прочнее она связывается с частицами модифицированного силикагеля. Поэтому при элюции вначале выделяются наиболее гидрофильные белки, а в последнюю очередь - наиболее гидрофобные (см. рисунок, внизу слева).
Способность белков избирательно взаимодействовать с определёнными лигандами составляет основу метода аффинной или биоспецифической хроматографии. Например, для выделения нужного фермента можно использовать адсорбенты, с которыми ковалентно связан его субстрат, кофермент или специфический эффектор; для извлечения из разделяемой смеси гормонов применяют связывание их иммобилизованными рецепторами и наоборот. Наиболее перспективно для выделения белков использование иммуносорбентов на основе моноклональных антител.
При пропускании смеси белков через биоспецифический сорбент нужный белок удерживается аффинной колонкой, в то время как все остальные компоненты проходят через неё, не задерживаясь. Затем осуществляется элюция специфически связанного белка (см. рисунок, внизу справа).
